郑州52岁代生龙凤胎：用于体外受精胚胎移植的人类胎盘组织中关键基因和miRNA的综合分析

作者: 试管君   点击次数:    发布时间: 2023-04-08 09:46

　　文章来源

　　内分泌学前沿》.2021年11月；12:774997

　　研究类型

　　实验性研究

　　材料方法

　　1.胎盘组织的采集：胎盘组织样本采集自IVF-ET妊娠和自然妊娠后的剖腹产。此外，还收集了8个来自IVF-ET妊娠的胎盘组织和8个来自自然妊娠的胎盘组织作为验证组群。在可能的情况下，选择整个中央胎盘的组织，以尽量减少其他部位对基因表达的影响。所有的胎盘组织都用预冷的PBS冲洗，并储存在-80℃，直到随后的RNA提取。组织的采集得到了郑州大学第三附属医院伦理委员会的批准，并在样本采集前获得了所有患者的书面知情同意。2.

　　2） 纳入标准。①纳入标准。IVF-ET妊娠后单胎；妊娠37~42周；婴儿出生体重2500~4000g；年龄20~35岁，无妊娠并发症；②选择严格匹配的自然妊娠的母亲作为对照组，匹配参数包括：母亲年龄、分娩、妊娠周数和胎儿性别。

　　3）RNA提取和测序：分离RNA，检查RNA浓度和完整性，然后对样品进行文库制备和测序。每个样品的测序至少有1000万个读段，质量大于20的碱基比例大于95%，质量控制符合数据分析的要求。

　　4.差异表达分析：使用R 3.5.2的DESeq2软件包分析差异表达的miRNAs和基因，并使用贝叶斯方法校正批次效应。差异表达的miRNAs和mRNAs用倍数变化>1.5和P<0.05作为筛选标准进行分析。

　　5.转录因子靶点的GO富集分析。将DEmiRs上传到FunRich软件，以筛选上游转录因子以及转录因子途径的扩展靶点，并进行GO富集分析。

　　MiRNA-mRNA调控网络的构建：使用miRWalk V2.0、StarBase和TargetScan数据库预测DEmiRs的靶基因。然后，将预测的靶基因与DEGs相匹配，用Cytoscape软件构建miRNA-mRNA调控网络。

　　GO和KEGG富集分析：对DEGs进行GO和KEGG富集分析，并使用R Studio中的ggplot2包来识别与DEGs相关的明显改变的生物过程、细胞成分、分子功能和相关路径。

　　8.分析蛋白质相互作用网络和识别关键基因。将差异表达的基因上传到STRING数据库。综合得分>0.4的相互作用被认为是显著的。PPI网络中的目标基因被作为节点，来自两个节点的线表示相关的相互作用。使用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化。使用Cytosscape的CytoHubba插件将与其他基因关联最强的10个基因确定为关键基因。

　　9.定量实时荧光PCR：使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒将1毫克的总RNA转录成cDNA。使用特定的引物合成miRNA的cDNA。进行定量实时荧光PCR，将结果与U6标准化，并使用2-CT方法计算相对表达变化。

　　研究结果

　　体外受精胚胎胎盘中差异表达基因的鉴定。共鉴定出12个差异表达的miRNAs，包括4个下调的miRNAs：hsa-miR-1269a、hsa-miR204-5p、hsa-miR-224-5p和hsa-miR-941，以及8个上调的miRNAs。hsa-miR -1269b, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-193B-3p, hsa-miR-193B-5p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-371a-5p, hsa-miR4286 和 hsa-miR-9-5p。此外，还发现了258个不同表达的mRNAs，其中52个下调，206个上调。

　　与对照组相比，IVF-ET组中hsa-miR-204-5p、hsa-miR-1269a和hsa-miR-941的相对表达明显下调，而hsa-miR-4286、hsa-miR-31-5p和hsa-miR-125b -5p的相对表达则分别上调。结果表明，这些miRNA的表达失调发生在IVF-ET衍生的胎盘组织中，但需要进一步验证以支持测序数据和研究分析的准确性。

　　转录因子和GO富集分析：确定了SP1、EGR1、SP4、KLF7、ONECUT 1、MYF5、TCF3、NFIC、SRF和HOXB4与DEmiRs之间的相互调节。SP1能够调节大部分的DEmiRs。GO富集分析显示，5个主要生物过程

　　构建蛋白质相互作用网络。使用STRING在线数据库和Cytoscape中的工具，建立了一个PPI网络，评估其连通性并确定了十个关键基因。

　　关键基因的生物学分析：使用Cytoscape插件cytoHubba揭示了IVF-ET中DEGs之间最密切相关的十个基因的相互作用。最可能的关键基因包括EGFR、FOS、SERPINE1、LEP、HGF、EGR1、SPP1、HNRNPA2B1、IGF2和ENG。对这10个基因的KEGG富集分析表明，MAPK途径以及PI3K-Akt途径被明显富集。

　　讨论

　　在本研究中，与自然妊娠的胎盘组织相比，IVF-ET妊娠的胎盘组织中共发现了12个不同表达的miRNAs，其中hsa-miR-204-5p、hsamiR-1269a和hsa-miR-941在IVF-ET胎盘组织中被特异性地下调。虽然潜在的机制仍不清楚，但所有这三种miRNA被认为与胎盘功能障碍和胎儿生长有关。

　　最丰富的转录因子是特异性蛋白1，它是一种锌指转录因子，与各种富含GC的图案结合，调节miRNA的表达，以及功能与胚胎发育和分化有关的基因的表达。

　　我们的研究确定了10个主要与胎盘发育和胎儿生长有关的关键基因。

　　在miRNA-mRNA调控网络中，下调的DeMiRs具有更广泛的靶基因，尤其是miR-204-5p、miR-1269a和miR-941，这些基因参与了对胎盘功能的调节。DeMiRs对靶基因的调控以及对胎盘功能的影响将在进一步的实验中进行研究。

　　选择相对较小的样本量进行验证可能会降低研究结果的可靠性。此外，生物信息学分析所提示的分子相互作用和功能关系需要在实验中加以验证。

　　结论

　　我们的数据揭示了先前确定的与胎盘功能障碍和妊娠并发症有关的miRNAs和mRNAs，以及新的候选基因。这些数据为后续研究IVF-ET对胎盘发育和功能的影响提供了宝贵的资源，并可能为今后预防和改善围产期不良结局提供依据。